Спектрометр кругового дихроизма Applied Photophysics Chirascan V100

Applied Photophysics Chirascan V100 — спектрометр кругового дихроизма с максимальной чувствительностью и количественной калибровкой.

Производитель: Applied Photophysics

Запросить коммерческое предложение Запросить сервисную поддержку

В основе Chirascan V100 лежат характеристики и инновации, представленные в 2004 году, когда был запущен Chirascan. По прошествии нескольких лет развития системы на рынок вышел Chirascan V100, который значительно превосходит базовую модель в производительности и чувствительности во всех КД-приложениях.

Спектрометр кругового дихроизма Chirascan V100 позволяет:

Быстро проанализировать белки и другие сложные молекулы;
Извлечь максимум информации из минимального количества образца;
Значительно уменьшить время, затраченное на эксперимент;
Одновременно производить точные измерения КД, абсорбции и флуоресценции.

В Chirascan V100 реализовано прямое измерении абсорбции, а не преобразование напряжения на детекторе в примерные значения поглощения. Абсорбция в ходе температурных экспериментов укажет на агрегацию, будет ясно, что КД-спектр изменился не только из-за изменения конформации объекта, а просто потому, что он начал агрегировать.

Chirascan V100 разработан для наиболее требовательных областей исследований, таких как био-фармацевтика и разработка новых структур, когда количество образца и время, затраченное на эксперимент, стоят на первом месте.

Спектрометр кругового дихроизма Chirascan V100 открывает новый подход к дизайну эксперимента, основанный на высокой плотности данных, быстрому получению информации и малых объемах образцов.

Более того, Applied Photophysics разработали метод динамической мультимодальной спектроскопии, Dynamic Multimode Spectroscopy (DMS), чтобы по максимуму использовать преимущества модели Chirascan V100 для получения структурных и термодинамических данных с образца малого объема в рамках одного эксперимента. Экономия образца, одновременное измерение кругового дихроизма, абсорбции и флуоресценции, скорость получения данных и мощное аналитическое программное обеспечение позволяет снизить количество экспериментов, повысить качество и сделать этот процесс простым и быстрым.

Ключевые особенности:

Детальный структурный анализ биомолекул (белки, РНК, ДНК);
Выдающаяся чувствительность обеспечивает точный и быстрый результат;
Мощное программное обеспечение для легкой настройки прибора, вывода и анализа данных;
Большой набор дополнительных модулей максимизирует области применения;
Малый износ расходных материалов минимизирует расходы на эксплуатацию прибора.

Одно из принципиальных применений Chirascan V100 — это определение вторичной и третичной структуры белков путем измерения спектров кругового (КД) дихроизма, индуцированных ароматическими боковыми цепями и дисульфидными связями.

Вторичная и третичная структуры белков изменяются при стрессовых воздействиях, например таких как температура или рН, а круговой дихроизм используют для определения конформационной стабильности при изменениях в среде. Такое применение играет важную роль в разработке биотерапевтических препаратов при оптимизации условий хранения.

Круговой дихроизм также используют при изучении биосовместимости для демонстрации конформационной эквивалентности материалов из разных источников, а также для определения правильного фолдинга новых белков.

Дополнительные модули:

CS/PCS: Однокамерный термостат Пельтье;
CS/PCM: 4-кюветный механизм автоматической смены кюветы с термостатом Пельтье;
CS/TT: Двухшприцевой модуль титрования;
CS/TF: Флуоресцентный детектор;
CS/FP: Вспомогательное оборудование для флуоресцентной поляризации/анизотропии;
CS/SM: Сканирующий монохроматор;
CS/MCD: Магнитный круговой дихроизм;
FDCD: Флуоресцентно-детектируемый круговой дихроизм;
CS/MC: Мультиканальная флуоресценция;
J100: Холодильник Julabo AWC-100 для термостата Пельтье;
CS/LD: Детектор линейного дихроизма;
CS/ORD: Вспомогательное оборудование для определения дисперсии оптического вращения;
CS/CPL: Круговая поляризация флуоресценции;
CS/IR: Фотодетектор для ближней ИК-области спектра излучения;
CS/LT: Азотный криостат (дополнительное оборудование);
CS/CFR: Соответствие разделу 21, части 11 Свода федеральных постановлений;
CS/SF: Модуль остановленного потока.

Аксессуары:

Глобальный термодинамический анализ;
CCD детектор эмиссии;
Ячейка Куэтт для ЛД;
6-позиционный держатель;
Титрационный модуль;
pH-метр;
Модуль stopped flow;
Интеграционная сфера;
Держатель для тонких пленок и диск KBr;
Специальные детекторы для флуоресценции/анизотропии;

Источник света:

Ксеноновая лампа мощностью 150W, воздушное охлаждение.

Стандартный детектор:

Твердотельный детектор.

Монохроматор:

С двумя призмами, обе призмы поляризующие.

Диапазон длин волн:

163 – 1150 нм (+ опциональный ИК-детектор).

Спектральное разрешение:

±0.1 нм.

Калибровка КД и точность:

Оптика, многоволновая;
Точность ± 1%, определенная во всем диапазоне длин волн (выбранные длины волн).

Точность установки длины волны:

±0.1 нм (163 — 500 нм);
±0.3 нм (500-600 нм);
±0.4 нм (600-900 нм);
±1.0 нм (>900 нм).

Воспроизводимость:

< ±0.025 нм;

Минимальный шаг установки длины волны:

0.025 нм;

Ширина спектральной полосы:

0.01 — > 25 нм;

Точность установки ширины спектральной полосы:

±0.1 нм на 267 нм;

Ширина щели:

0,125 — 10000 мкм;

Цифровое время накопления:

0,05 мс — 200 с<;

Полный диапазон КД:

± 8000 мград;

Разрешение КД:

0,000001 мград;

Динамический диапазон КД:

Никаких искажений КД даже при оптической плотности 3.

Рассеяние:

< 3 ppm при 200 нм;

Чувствительность (стандартные значения RMS-шума без образца с шириной полосы 1 нм, временем накопления 2 сек. без сглаживания и использования rolling averaging):

0.03 мград @ 180 нм;
0.03 мград@ 185 нм;
0.03 мград @ 250 нм;
0.03 мград @ 500 нм.

Стабильность базовой линии:

± 0.006 мград/час.

Температурный рампинг:

Возможна съемка температурных кривых на множестве длин волн в одном непрерывном эксперименте по термической денатурации.

Максимальный расход азота, давление, чистота:

5 литров/мин. на всем диапазоне длин волн, 4 бар, 99,998%.

Продувка азотом и контроль включения лампы:

Контроль продувки азотом и включения лампы через ПО;
Предустановка и автоматическое включение подачи азота и лампы;
Предустановка выключения подачи азота и лампы;
Автоматическое выключение лампы при недостатке азота.

Вес и размеры инструмента (ШхГхВ):

160 кг, 150х55х60 см.

Рабочая температура:

От 20 до 25°C, контролируемая с точностью до 1,5°C.

Рабочая влажность:

От 20 до 80% без конденсации.

Другие стандартные возможности:

Пельтье-контроль температуры;
Внешний температурный зонд;
Продвинутые режимы сканирования и кинетических экспериментов;
ПО ProData Viewer для просмотра и анализа данных, включая фиттинг температурных кривых, анализ кинетики, вторичной структуры;
Неограниченное количество компьютеров, на которых может быть установлено ПО;
USB-интерфейс.

Введение в спектроскопию кругового дихроизма

Круговой дихроизм (КД) представляет собой разницу в поглощении левовращающей (L-CPL) и правовращающей (R-CPL) составляющих циркулярно поляризованного света и проявляется в молекулах, которые содержат один или более хиральный хромофор (светопоглощающие группы).

Круговой дихроизм = ΔA(λ) = A(λ)LCPL — A(λ)RCPL

Спектроскопия кругового дихроизма — это техника измерения КД-спектров на разных длинах волн. Этот метод широко используется для изучения хиральных молекул всех типов и размеров, наибольшее применение он находит применительно к большим биологическим молекулам. Основная область применения — анализ вторичной структуры или конформаций макромолекул, в частности белков. Поскольку их вторичная структура чувствительна к окружению, температуре и pH, КД можно использовать для наблюдения за изменениями вторичной структуры под воздействием внешних факторов, в том числе взаимодействий с другими молекулами.

Из спектра КД можно извлечь информацию о структуре, кинетике, а также термодинамические показатели макромолекул. Измерения в видимой УФ областях спектра позволяют фиксировать электронные переходы и, если изучаемая молекула содержит хиральные хромофоры, то лево- или право-циркулярно поляризованный свет будет поглощаться лучше, и результирующий КД-сигнал на соответствующих длинах волн будет ненулевым.

Сигнал КД может быть как положительным, так и отрицательным в зависимости от того которая из компонент (левая или правая) сильнее поглощает на данной длине волны. Ниже приведен пример спектра кругового дихроизма с несколькими пиками, который демонстрирует изменения сигнала КД как функции длины волны, а также возможность присутствия в одном спектре как отрицательных, так и положительных пиков.

Рисунок 1 — Спектр кругового дихроизма витамина В12.

Спектры кругового дихроизма измеряются с помощью КД спектрометра, такого как Chirascan, который по принципу действия похож на обычный спектрометр, работающий на поглощение. КД спектрометры измеряют по очереди левую и правую КД-компоненту, обычно с частотой 50 кГц, а затем рассчитывают сигнал КД.

Основы поляризации

Чтобы понять явление кругового дихроизма, необходимо сначала разобраться в основах поляризации света. Линейно поляризованным называют свет, чьи колебания находятся в одной плоскости. Все состояния поляризованного света можно описать как сумму двух линейных составляющих, расположенных под прямым углом друг к другу, обычно и представляют как вертикально и горизонтально поляризованный свет.

Рисунок 2 — Вертикально поляризованный свет / Горизонтально поляризованный свет.

Если мы совместим горизонтально и вертикально поляризованные волны одинаковой амплитуды, находящиеся в фазе друг относительно друга, то результирующей волной (синяя) будет линейно поляризованная под углом 45 градусов, как показано на рисунке 3.

Рисунок 3 — Свет, поляризованный под углом 45 градусов.

Если же две линейно поляризованных составляющих не в фазе, результирующая волна уже не будет линейно поляризованной. к примеру, если разница фаз составляет 1/4 волны, результатом суперпозиции будет спираль. Это уже циркулярно поляризованный свет. Спираль может быть как левовращающей, так и правовращающей. Оптический элемент, который превращает линейно поляризованный свет в циркулярно поляризованный четвертьволновая пластина (quarter-wave plate). Она двулучепреломляющая, то есть показатель преломления для вертикально и горизонтально поляризованного света разный. Должным образом ориентированная пластина преобразует линейно-поляризованный свет в циркулярно поляризованный за счет замедления одной из линейных компонент пучка относительно другой, таким образом, чтобы она отставала на четверть волны. Таким образом формируется пучок лево- или правовращающего циркулярно поляризованного света.

Рисунок 4 — Лево-вращающий циркулярно поляризованный свет.

Рисунок 5 — Право-вращающий циркулярно поляризованный свет.

Разница в абсорбции левовращающего и правовращающего циркулярно поляризованного света — основа кругового дихроизма. Молекула, которая поглощает левую и правую компоненту по-разному, называется оптически активной или хиральной.

Что такое qCD?

qCD заново определяет приложения метода спектроскопии кругового дихроизма, представляя новые принципы, которые делают КД действительно количественным методом.

Впервые КД спектрометр можно откалибровать с использованием абсолютного стандарта на множестве длин волн во всем диапазоне.

Количественная калибровка позволяет иначе взглянуть на результаты измерений КД. Необходимость такой методики была продемонстрирована Knightetal¹ (NationalPhysicalLaboratory, UK). В результате исследования была показана «…невысокая достоверность метода КД вследствие большой разницы в результатах, полученных разными лабораториями и даже разными операторами», и авторы пришли к выводу, что «отсутствие абсолютного стандарта и возможностей контроля качества в КД-измерениях приводит невысокой достоверности результатов и метода в целом».

Возможности КД ограничены, если исследователи не уверены в точности своих данных. Измерения на Chirascan qCD точны, а значит несут в себе гораздо больше информации, поскольку пользователь может ставить вопрос уже таким образом: велика ли разница в КД спектре по сравнению с моими более ранними результатами или с результатами моих коллабораторов? То же самое и в фармацевтической промышленности, КД используется для сравнения больших количеств образцов, с течением времени и на разных производственных площадках – и количественные данные здесь просто необходимы. Неточные измерения при скрининге могу вылиться в большие расходы. Службы контроля и регулирующие органы все чаще требуют статистически значимые данные. А для этого необходимо иметь данные, точность которых известна.

DichOS (Dichroism Optical Standard) это новый нехимический, мультиреференсный стандарт калибровки КД, который исключает неточности, возможные с использованием традиционного стандарта с одним референсным пиком. DichOS открывает путь к получению абсолютных значений КД, и сравнение КД-спектров, измеренных на разных приборах или в разное время становиться обычной процедурой. DichOS изготовлен из оптических компонентов с известными физическими характеристиками. Это позволяет сгенерировать референсный спектр, который и используется для калибровки спектра, снятого с DichOS. Получается калибровочная кривая с множеством точек, и ее точность составляет ±1% на всех длинах волн.

Dichos

DichOS позволяет получить спектр, показанный на рисунке 6. Референсный спектр (красный) можно рассчитать очень точно, и его сравнивают с измеренным спектром (синий).

dichos Рисунок 6 — Спектр, содержащий множество пиков от УФ до ИК областей спектра.

Точность — погрешности рассчитываются и отображаются для каждого измерения

Chirascan qCD всегда производит дискретные измерения КД. Сглаженные или полученные методом rollingaverage измерения не используются, поскольку это по сути результат наложения сигналов, полученных на разных длинах волн. В каждой точке спектра КД рассчитывается стандартная ошибка (исходя из множества измерений, сделанных на каждой длине волны). Ошибку можно отобразить в стандартной форме. Погрешности, которые добавляются в результате вычислений в ПО ProData, например, коррекции базовой линии и усреднения по нескольким спектрам также рассчитываются и эти данные добавляются в файл.

Улучшенная стабильность КД

Важным параметром для КД-спектрометра является стабильность сигнала КД как функции температуры. Спектрометры qCD обладают отличной стабильностью, особенно если речь идет о колебаниях температуры. Только Applied Photophysics предоставляют такие данные в спецификации (≤0.01 mdeg/°C в диапазоне от 170 до 650 нм).

Анализ — статистическое (количественное) сравнение структур высокого порядка

Программное обеспечение qBiC. Сравнение и расчет различий в КД спектре требует измерений, точность которых известна. Это стало возможно с qCD. qBiC – это программный компонент, который позволяет производить количественное сравнение спектроскопических данных путем установления, являются ли различия в спектрах статистически значимыми. qBiC задействует множество подходов для вычисления сходства спектров.

В приведенном ниже примере наложены 4 КД-спектра инсулина и инсулина, связанного с 2.5%, 5% и 10% lispro. На первый взгляд спектры выглядят одинаковыми. Однако статистический анализ с использованием qBiC показывает, что они отличаются и эти различия можно вычислить. В представленном исследовании использовались два статистических метода. Результаты представлены на рисунке 7.

Рисунок 7 — Результаты наложения 4 КД-спектра инсулина и инсулина, связанного с 2.5%, 5% и 10% lispro.

*Если p < 0.05 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.
**Если Z > 2 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.