Спектрометр кругового дихроизма Applied Photophysics Chirascan V100

• Детальный структурный анализ биомолекул (белки, РНК, ДНК);
• Выдающаяся чувствительность обеспечивает точный и быстрый результат;
• Мощное программное обеспечение для легкой настройки прибора, вывода и анализа данных;
• Большой набор дополнительных модулей максимизирует области применения;
• Малый износ расходных материалов минимизирует расходы на эксплуатацию прибора.

Одно из принципиальных применений Chirascan V100 — это определение вторичной и третичной структуры белков путем измерения спектров кругового (КД) дихроизма, индуцированных ароматическими боковыми цепями и дисульфидными связями.

Вторичная и третичная структуры белков изменяются при стрессовых воздействиях, например таких как температура или рН, а круговой дихроизм используют для определения конформационной стабильности при изменениях в среде. Такое применение играет важную роль в разработке биотерапевтических препаратов при оптимизации условий хранения.

Круговой дихроизм также используют при изучении биосовместимости для демонстрации конформационной эквивалентности материалов из разных источников, а также для определения правильного фолдинга новых белков.

Chirascan V100 разработан для наиболее требовательных областей исследований, таких как био-фармацевтика и разработка новых структур, когда количество образца и время, затраченное на эксперимент, стоят на первом месте.

Спектрометр кругового дихроизма Chirascan V100 открывает новый подход к дизайну эксперимента, основанный на высокой плотности данных, быстрому получению информации и малых объемах образцов.

Более того, Applied Photophysics разработали метод динамической мультимодальной спектроскопии, Dynamic Multimode Spectroscopy (DMS), чтобы по максимуму использовать преимущества модели Chirascan V100 для получения структурных и термодинамических данных с образца малого объема в рамках одного эксперимента. Экономия образца, одновременное измерение кругового дихроизма, абсорбции и флуоресценции, скорость получения данных и мощное аналитическое программное обеспечение позволяет снизить количество экспериментов, повысить качество и сделать этот процесс простым и быстрым.

Chirascan V100 — необходимый инструмент в арсенале биофизических техник, используемых для анализа биомолекул.

Дополнительные модули:

• CS/PCS Однокамерный термостат Пельтье;
• CS/PCM 4-кюветный механизм автоматической смены кюветы с термостатом Пельтье;
• CS/TT Двухшприцевой модуль титрования;
• CS/TF Флуоресцентный детектор;
• CS/FP Вспомогательное оборудование для флуоресцентной поляризации/анизотропии;
• CS/SM Сканирующий монохроматор;
• CS/MCD Магнитный круговой дихроизм;
• FDCD Флуоресцентно-детектируемый круговой дихроизм;
• CS/MC Мультиканальная флуоресценция;
• J100 Холодильник Julabo AWC-100 для термостата Пельтье;
• CS/LD Детектор линейного дихроизма;
• CS/ORD Вспомогательное оборудование для определения дисперсии оптического вращения;
• CS/CPL Круговая поляризация флуоресценции;
• CS/IR Фотодетектор для ближней ИК-области спектра излучения;
• CS/LT Азотный криостат (дополнительное оборудование);
• CS/CFR Соответствие разделу 21, части 11 Свода федеральных постановлений;
• CS/SF Модуль остановленного потока.

Источник света: Ксеноновая лампа мощностью 150W, воздушное охлаждение

Стандартный детектор: Твердотельный детектор.

Монохроматор: С двумя призмами, обе призмы поляризующие.

Диапазон длин волн: 163 – 1150 нм (до 1700 нм с опциональным ИК-детектором).

Калибровка КД и точность:

• Оптика, многоволновая;
• Точность ± 1%, определенная во всем диапазоне длин волн (выбранные длины волн).

Точность установки длины волны:

• ±0.1 нм (163 — 500 нм);
• ±0.3 нм (500-600 нм);
• ±0.4 нм (600-900 нм);
• ±1.0 нм (>900 нм).

Воспроизводимость: < ±0.025 нм.

Минимальный шаг установки длины волны: 0.025 нм.

Ширина спектральной полосы: 0.01 — > 25 нм<./p>

Точность установки ширины спектральной полосы: ±0.1 нм на 267 нм.

Ширина щели: 0,125 — 10000 мкм.

Цифровое время накопления: 0,05 мс-200 с.

Полный диапазон КД: ± 8000 мгра.д

Разрешение КД: 0,000001 мград.

Динамический диапазон КД: никаких искажений КД даже при оптической плотности 3.

Рассеяние: < 3 ppm при 200 нм.

Чувствительность (стандартные значения RMS-шума без образца с шириной полосы 1 нм, временем накопления 2 сек. без сглаживания и использования rolling averaging):

• 0.03 мград @ 180 нм;
• 0.03 мград@ 185 нм;
• 0.03 мград @ 250 нм;
• 0.03 мград @ 500 нм.

Стабильность базовой линии: ± 0.006 мград/час.

Температурный рампинг: Возможна съемка температурных кривых на множестве длин волн в одном непрерывном эксперименте по термической денатурации.

Расход азота, давление, чистота: 5 литров/мин., 4 бар, 99,998%.

Продувка азотом и контроль включения лампы:

• Контроль продувки азотом и включения лампы через ПО;
• Предустановка и автоматическое включение подачи азота и лампы;
• Предустановка выключения подачи азота и лампы;
• Автоматическое выключение лампы при недостатке азота.

Другие стандартные возможности: Пельтье-контроль температуры, внешний температурный зонд, продвинутые режимы сканирования и кинетических экспериментов, ПО ProData Viewer для просмотра и анализа данных, включая фиттинг температурных кривых, анализ кинетики, вторичной структуры, количество компьютеров, на которых может быть установлено ПО, неограничено, USB-интерфейс.

Доступен широкий круг аксессуаров и дополнительных модулей, включая глобальный термодинамический анализ, CCD детектор эмиссии, ячейка Куэтт для ЛД, 6-позиционный держатель, титрационный модуль, pH-метр, модуль stopped flow, интеграционную сферу, держатель для тонких пленок и диск KBr, специальные детекторы для флуоресценции/анизотропии, сканирующий эмиссионный монохроматор, криостат, детекцию ORD, магнитный КД, кастомизированные держатели, 21CFR Part II compliance software и IQOQPQ Validation Service.

Вес и размеры инструмента (ШхГхВ): 60 кг, 150 х 55 х 60 см.

Условия эксплуатации:

• Температура: От 20 до 25°C, контролируемая с точностью до 1,5°C;
• Влажность: От 20 до 80% без конденсации.

Введение в спектроскопию кругового дихроизма

Круговой дихроизм (КД) представляет собой разницу в поглощении левовращающей (L-CPL) и правовращающей (R-CPL) составляющих циркулярно поляризованного света и проявляется в молекулах, которые содержат один или более хиральный хромофор (светопоглощающие группы).

Круговой дихроизм = ΔA(λ) = A(λ)LCPL — A(λ)RCPL, где λ — длина волны.

Спектроскопия кругового дихроизма — это техника измерения КД-спектров на разных длинах волн. Этот метод широко используется для изучения хиральных молекул всех типов и размеров, наибольшее применение он находит применительно к большим биологическим молекулам. Основная область применения — анализ вторичной структуры или конформаций макромолекул, в частности белков. Поскольку их вторичная структура чувствительна к окружению, температуре и pH, КД можно использовать для наблюдения за изменениями вторичной структуры под воздействием внешних факторов, в том числе взаимодействий с другими молекулами. Из спектра КД можно извлечь информацию о структуре, кинетике, а также термодинамические показатели макромолекул. Измерения в видимой УФ областях спектра позволяют фиксировать электронные переходы и, если изучаемая молекула содержит хиральные хромофоры, то лево- или право-циркулярно поляризованный свет будет поглощаться лучше, и результирующий КД-сигнал на соответствующих длинах волн будет ненулевым. Сигнал КД может быть как положительным, так и отрицательным в зависимости от того которая из компонент (левая или правая) сильнее поглощает на данной длине волны. Ниже приведен пример спектра кругового дихроизма с несколькими пиками, который демонстрирует изменения сигнала КД как функции длины волны, а также возможность присутствия в одном спектре как отрицательных, так и положительных пиков.

Спектр кругового дихроизма витамина В12.

Спектры кругового дихроизма измеряются с помощью КД спектрометра, такого как Chirascan, который по принципу действия похож на обычный спектрометр, работающий на поглощение. КД спектрометры измеряют по очереди левую и правую КД-компоненту, обычно с частотой 50 кГц, а затем рассчитывают сигнал КД.

Основы поляризации

Чтобы понять явление кругового дихроизма, необходимо сначала разобраться в основах поляризации света. Линейно поляризованным называют свет, чьи колебания находятся в одной плоскости. Все состояния поляризованного света можно описать как сумму двух линейных составляющих, расположенных под прямым углом друг к другу, обычно и представляют как вертикально и горизонтально поляризованный свет. Изображения ниже служат наглядной демонстрацией.

Вертикально поляризованный свет Горизонтально поляризованный свет.

Если мы совместим горизонтально и вертикально поляризованные волны одинаковой амплитуды, находящиеся в фазе друг относительно друга, то результирующей волной (синяя) будет линейно поляризованная под углом 45 градусов, как показано на изображении ниже:

Свет, поляризованный под углом 45 градусов.

Если же две линейно поляризованных составляющих не в фазе, результирующая волна уже не будет линейно поляризованной. к примеру, если разница фаз составляет 1/4 волны, результатом суперпозиции будет спираль. Это уже циркулярно поляризованный свет. Спираль может быть как левовращающей, так и правовращающей. Оптический элемент, который превращает линейно поляризованный свет в циркулярно поляризованный четвертьволновая пластина (quarter-wave plate). Она двулучепреломляющая, то есть показатель преломления для вертикально и горизонтально поляризованного света разный. Должным образом ориентированная пластина преобразует линейно-поляризованный свет в циркулярно поляризованный за счет замедления одной из линейных компонент пучка относительно другой, таким образом, чтобы она отставала на четверть волны. Таким образом формируется пучек лево- или правовращающего циркулярно поляризованного света.

Лево-вращающий циркулярно поляризованный свет.

Право-вращающий циркулярно поляризованный свет.

Разница в абсорбции левовращающего и правовращающего циркулярно поляризованного света — основа кругового дихроизма. Молекула, которая поглощает левую и правую компоненту по-разному, называется оптически активной или хиральной.

Что такое qCD?

qCD заново определяет приложения метода спектроскопии кругового дихроизма, представляя новые принципы, которые делают КД действительно количественным методом.

Впервые КД спектрометр можно откалибровать с использованием абсолютного стандарта на множестве длин волн во всем диапазоне.

Количественная калибровка позволяет иначе взглянуть на результаты измерений КД. Необходимость такой методики была продемонстрирована Knightetal¹ (NationalPhysicalLaboratory, UK). В результате исследования была показана «невысокая достоверность метода КД вследствие большой разницы в результатах, полученных разными лабораториями и даже разными операторами», и авторы пришли к выводу, что «отсутствие абсолютного стандарта и возможностей контроля качества в КД-измерениях приводит невысокой достоверности результатов и метода в целом».

Возможности КД ограничены, если исследователи не уверены в точности своих данных. Измерения на Chirascan qCD точны, а значит несут в себе гораздо больше информации, поскольку пользователь может ставить вопрос уже таким образом: велика ли разница в КД спектре по сравнению с моими более ранними результатами или с результатами моих коллабораторов? То же самое и в фармацевтической промышленности, КД используется для сравнения больших количеств образцов, с течением времени и на разных производственных площадках – и количественные данные здесь просто необходимы. Неточные измерения при скрининге могу вылиться в большие расходы. Службы контроля и регулирующие органы все чаще требуют статистически значимые данные. А для этого необходимо иметь данные, точность которых известна.

DichOS (Dichroism Optical Standard) — это новый нехимический, мультиреференсный стандарт калибровки КД, который исключает неточности, возможные с использованием традиционного стандарта с одним референсным пиком. DichOS открывает путь к получению абсолютных значений КД, и сравнение КД-спектров, измеренных на разных приборах или в разное время становиться обычной процедурой. DichOS изготовлен из оптических компонентов с известными физическими характеристиками. Это позволяет сгенерировать референсный спектр, который и используется для калибровки спектра, снятого с DichOS. Получается калибровочная кривая с множеством точек, и ее точность составляет ±1% на всех длинах волн.

DichOS позволяет получить спектр, содержащий множество пиков от УФ до ИК областей спектра. (см. на рис. слева). Референсный спектр (красный) можно рассчитать очень точно, и его сравнивают с измеренным спектром (синий).

Точность: погрешности рассчитываются и отображаются для каждого измерения

Chirascan qCD всегда производит дискретные измерения КД. Сглаженные или полученные методом rollingaverage измерения не используются, поскольку это по сути результат наложения сигналов, полученных на разных длинах волн. В каждой точке спектра КД рассчитывается стандартная ошибка (исходя из множества измерений, сделанных на каждой длине волны). Ошибку можно отобразить в стандартной форме (см. рисунок). Погрешности, которые добавляются в результате вычислений в ПО ProData, например, коррекции базовой линии и усреднения по нескольким спектрам также рассчитываются и эти данные добавляются в файл.

Улучшенная стабильность КД

Важным параметром для КД-спектрометра является стабильность сигнала КД как функции температуры. Спектрометры qCD обладают отличной стабильностью, особенно если речь идет о колебаниях температуры. Только Applied Photophysics предоставляют такие данные в спецификации (≤0.01 mdeg/°C в диапазоне от 170 до 650 нм).

Анализ: статистическое (количественное) сравнение структур высокого порядка

Программное обеспечение qBiC. Сравнение и расчет различий в КД спектре требует измерений, точность которых известна. Это стало возможно с qCD. qBiC – это программный компонент, который позволяет производить количественное сравнение спектроскопических данных путем установления, являются ли различия в спектрах статистически значимыми. qBiC задействует множество подходов для вычисления сходства спектров.

В приведенном примере наложены 4 КД-спектра инсулина и инсулина, связанного с 2.5%, 5% и 10% lispro. На первый взгляд спектры выглядят одинаковыми. Однако статистический анализ с использованием qBiC показывает, что они отличаются и эти различия можно вычислить. В представленном исследовании использовались два статистических метода. Результаты приведены в представленной ниже таблице:

Если P < 0.05 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.

Если Z > 2 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.

• CS Plus A study to validate DMS (Application note);
• CS Plus DMS Formulation stability of an antibody (Application note);
• Chirascan qCD RUS (Брошюра Chirascan на русском языке);
• Chirascan_Platform_Brochure_final_screen (Общая брошюра по семейству Chirascan на английском языке);
• Product-Information-Sheet_Chirascan-V100 (Брошюра Chirascan V100 на английском языке).

• ФГБУН институт биохимии им. А. Н. Баха РАН;
• ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА России.