Skip

Chirascan™ V100



В основе Chirascan™ V100 лежат характеристики и инновации, представленные в 2004 году, когда был запущен Chirascan™. По прошествии нескольких лет развития системы на рынок вышел Chirascan™ V100, который значительно превосходит базовую модель в производительности и чувствительности во всех КД-приложениях

запросить коммерческое предложение...запросить сервисную поддержку...

Более детальный анализ белков и других биомолекул.

Chirascan V100 позволяет:

  • Быстро проанализировать белки и другие сложные молекулы
  • Извлечь максимум информации из минимального количества образца
  • Значительно уменьшить время, затраченное на эксперимент
  • Одновременно производить точные измерения КД, абсорбции и флуоресценции

В Chirascan V100 реализовано прямое измерении абсорбции, а не преобразование напряжения на детекторе в примерные значения поглощения. Абсорбция в ходе температурных экспериментов укажет на агрегацию, будет ясно, что КД-спектр изменился не только из-за изменения конформации объекта, а просто потому, что он начал агрегировать.

  • Детальный структурный анализ биомолекул (белки, РНК, ДНК)
  • Выдающаяся чувствительность обеспечивает точный и быстрый результат
  • Мощное программное обеспечение для легкой настройки прибора, вывода и анализа данных
  • Большой набор дополнительных модулей максимизирует области применения
  • Малый износ расходных материалов минимизирует расходы на эксплуатацию прибора 

Одно из принципиальных применений Chirascan™ - это определение вторичной и третичной структуры белковпутем измерения спектров кругового (КД) дихроизма, индуцированных ароматическими боковыми цепями и дисульфидными связями.Вторичная и третичная структуры белков изменяются при стрессовых воздействиях, например, температуры или рН, а круговой дихроизм используют для определения конформационной стабильности при изменениях в среде. Такое применение играет важную роль в разработке биотерапевтических препаратов при оптимизации условий хранения. Круговой дихроизм также используют при изучении биосовместимости для демонстрации конформационной эквивалентности материалов из разных источников, а также для определения правильного фолдинга новых белков.  

Введение в спектроскопию кругового дихроизма

Круговой дихроизм (КД) представляет собой разницу в поглощении левовращающей (L-CPL) и правовращающей (R-CPL) составляющих циркулярно поляризованного света и проявляется в молекулах, которые содержат один или более хиральный хромофор (светопоглощающие группы).

Круговой дихроизм = ΔA(λ) = A(λ)LCPL - A(λ)RCPL, где λ - длина волны.

Спектроскопия кругового дихроизма - это техника измерения КД-спектров на разных длинах волн. Этот метод широко используется для изучения хиральных молекул всех типов и размеров, наибольшее применение он находит применительно к большим биологическим молекулам. Основная область применения - анализ вторичной структуры или конформаций макромолекул, в частности белков. Поскольку их вторичная структура чувствительна к окружению, температуре и pH, КД можно использовать для наблюдения за изменениями вторичной структуры под воздействием внешних факторов, в том числе взаимодействий с другими молекулами. Из спектра КД можно извлечь информацию о структуре, кинетике, а также термодинамические показатели макромолекул.

Измерения в видимой УФ областях спектра позволяют фиксировать электронные переходы и, если изучаемая молекула содержит хиральные хромофоры, то лево- или право-циркулярно поляризованный свет будет поглощаться лучше, и результирующий КД-сигнал на соответствующих длинах волн будет ненулевым. Сигнал КД может быть как положительным, так и отрицательным в зависимости от того которая из компонент (левая или правая) сильнее поглощает на данной длине волны. Ниже приведен пример спектра кругового дихроизма с несколькими пиками, который демонстрирует изменения сигнала КД как функции длины волны, а также возможность присутствия в одном спектре как отрицательных, так и положительных пиков.

e46ab1a9ee7927b8db46fbe08593a8bf.jpeg
Спектр кругового дихроизма витамина В12

Спектры кругового дихроизма измеряются с помощью КД спектрометра, такого как Chirascan, который по принципу действия похож на обычный спектрометр, работающий на поглощение. КД спектрометры измеряют по очереди левую и правую КД-компоненту, обычно с частотой 50 кГц, а затем рассчитывают сигнал КД.

Основы поляризации

Чтобы понять явление кругового дихроизма, необходимо сначала разобраться в основах поляризации света.

Линейно поляризованным называют свет, чьи колебания находятся в одной плоскости. Все состояния поляризованного света можно описать как сумму двух линейных составляющих, расположенных под прямым углом друг к другу, обычно и представляют как вертикально и горизонтально поляризованный свет. Изображения ниже служат наглядной демонстрацией.

467c9d2fada5010099c38d76b0a49fa8.gif
Вертикально поляризованный свет

f6ddd468b0f710b68704b061a94957b0.gif
Горизонтально поляризованный свет

Если мы совместим горизонтально и вертикально поляризованные волны одинаковой амплитуды, находящиеся в фазе друг относительно друга, то результирующей волной (синяя) будет линейно поляризованная под углом 45 градусов, как показано на изображении ниже:


e9ec826a2940e1175f759b06785afc37.gif
Свет, поляризованный под углом 45 градусов

Если же две линейно поляризованных составляющих не в фазе, результирующая волна уже не будет линейно поляризованной. к примеру, если разница фаз составляет 1/4 волны, результатом суперпозиции будет спираль. Это уже циркулярно поляризованный свет. Спираль может быть как левовращающей, так и правовращающей.

Оптический элемент, который превращает линейно поляризованный свет в циркулярно поляризованный четвертьволновая пластина (quarter-wave plate). Она двулучепреломляющая, то есть показатель преломления для вертикально и горизонтально поляризованного света разный. Должным образом ориентированная пластина преобразует линейно-поляризованный свет в циркулярно поляризованный за счет замедления одной из линейных компонент пучка относительно другой, таким образом, чтобы она отставала на четверть волны. Таким образом формируется пучек лево- или правовращающего циркулярно поляризованного света.

61f2d34af79090a71afa44798710426b.gif
Лево-вращающий циркулярно поляризованный свет

b83ac5bf5d9beb7dfbdf5354691bf497.gif
Право-вращающий циркулярно поляризованный свет

Разница в абсорбции левовращающего и правовращающего циркулярно поляризованного света - основа кругового дихроизма. Молекула, которая поглощает левую и правую компоненту по-разному, называется оптически активной или хиральной.

Что такое qCD?

qCD заново определяет приложения метода спектроскопии кругового дихроизма, представляя новые принципы, которые делают КД действительно количественным методом.

Впервые КД спектрометр можно откалибровать с использованием абсолютного стандарта на множестве длин волн во всем диапазоне.

Количественная калибровка позволяет иначе взглянуть на результаты измерений КД. Необходимость такой методики была продемонстрирована Knightetal1 (NationalPhysicalLaboratoryUK). В результате исследования была показана «…невысокая достоверность метода КД вследствие большой разницы в результатах, полученных разными лабораториями и даже разными операторами», и авторы пришли к выводу, что «отсутствие абсолютного стандарта и возможностей контроля качества в КД-измерениях приводит невысокой достоверности результатов и метода в целом».

Возможности КД ограничены, если исследователи не уверены в точности своих данных. Измерения на Chirascan qCD точны, а значит несут в себе гораздо больше информации, поскольку пользователь может ставить вопрос уже таким образом: велика ли разница в КД спектре по сравнению с моими более ранними результатами или с результатами моих коллабораторов? То же самое и в фармацевтической промышленности, КД используется для сравнения больших количеств образцов, с течением времени и на разных производственных площадках – и количественные данные здесь просто необходимы. Неточные измерения при скрининге могу вылиться в большие расходы. Службы контроля и регулирующие органы все чаще требуют статистически значимые данные. А для этого необходимо иметь данные, точность которых известна.

DichOS (Dichroism Optical Standard) это новый нехимический, мультиреференсный стандарт калибровки КД, который исключает неточности, возможные с использованием традиционного стандарта с одним референсным пиком. DichOS открывает путь к получению абсолютных значений КД, и сравнение КД-спектров, измеренных на разных приборах или в разное время становиться обычной процедурой. DichOS изготовлен из оптических компонентов с известными физическими характеристиками. Это позволяет сгенерировать референсный спектр, который и используется для калибровки спектра, снятого с DichOS. Получается калибровочная кривая с множеством точек, и ее точность составляет ±1% на всех длинах волн.

Dichos

DichOS позволяет получить спектр, содержащий множество пиков от УФ до ИК областей спектра. (см. на рис. слева). Референсный спектр (красный) можно рассчитать очень точно, и его сравнивают с измеренным спектром (синий).

dichos

Точность: погрешности рассчитываются и отображаются для каждого измерения

Chirascan qCD всегда производит дискретные измерения КД. Сглаженные или полученные методом rolling average измерения не используются, поскольку это по сути результат наложения сигналов, полученных на разных длинах волн. В каждой точке спектра КД рассчитывается стандартная ошибка (исходя из множества измерений, сделанных на каждой длине волны). Ошибку можно отобразить в стандартной форме (см. рисунок). Погрешности, которые добавляются в результате вычислений в ПО ProData, например, коррекции базовой линии и усреднения по нескольким спектрам также рассчитываются и эти данные добавляются в файл.

1519e164b9648822a130ade8c4358257.jpeg3370b4267c6f22d6fc84b74ca81916c4.jpeg

Улучшенная стабильность КД

Важным параметром для КД-спектрометра является стабильность сигнала КД как функции температуры. Спектрометры qCD обладают отличной стабильностью, особенно если речь идет о колебаниях температуры. Только Applied Photophysics предоставляют такие данные в спецификации (≤0.01 mdegв диапазоне от 170 до 650 нм).

Анализ: статистическое (количественное) сравнение структур высокого порядка

Программное обеспечение qBiC.Сравнение и расчет различий в КД спектре требует измерений, точность которых известна.Это стало возможно с qCDqBiC – это программный компонент, который позволяет производить количественное сравнение спектроскопических данных путем установления, являются ли различия в спектрах статистически значимыми. qBiC задействует множество подходов для вычисления сходства спектров.

711166a2ffd48bf9f69e6fd2cf0014aa.jpeg

В приведенном примере наложены 4 КД-спектра инсулина и инсулина, связанного с 2.5%, 5% и 10% lispro. На первый взгляд спектры выглядят одинаковыми. Однако статистический анализ с использованием qBiC показывает, что они отличаются и эти различия можно вычислить. В представленном исследовании использовались два статистических метода. Результаты приведены в представленной ниже таблице:   

8fd3fd260010dc86163aba6dd1c3d029.jpeg 

Если p < 0.05 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.

Если Z > 2 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.

Chirascan™-plus разработан для наиболее требовательных областей исследований, таких как био-фармацевтика и разработка новых структур, когда количество образца и время, затраченное на эксперимент, стоят на первом месте.

Chirascan™-plus открывает новый подход к дизайну эксперимента, основанный на высокой плотности данных, быстрому получению информации и малых объемах образцов. Более того, Applied Photophysics разработали метод динамической мультимодальной спектроскопии, Dynamic Multimode Spectroscopy (DMS), чтобы по максимум использовать преимущества модели Chirascan™-plus для получения структурных и термодинамических данных с образца малого объема в рамках одного эксперимента.

Экономия образца, одновременное измерение кругового дихроизма, абсорбции и флуоресценции, скорость получения данных и мощное аналитическое программное обеспечение позволяет снизить количество экспериментов, повысить качество и сделать этот процесс простым и быстрым. Chirascan™-plus - необходимый инструмент в арсенале биофизических техник, используемых для анализа новых протеинов.

Дополнительные модули:

  • CS/PCS Однокамерный термостат Пельтье
  • CS/PCM 4-кюветный механизм автоматической смены кюветы с термостатом Пельтье
  • CS/TT Двухшприцевой модуль титрования
  • CS/TF Флуоресцентный детектор
  • CS/FP Вспомогательное оборудование для флуоресцентной поляризации/анизотропии
  • CS/SM Сканирующий монохроматор
  • CS/MCD Магнитный круговой дихроизм
  • FDCD Флуоресцентно-детектируемый круговой дихроизм
  • CS/MC Мультиканальная флуоресценция
  • J100 Холодильник Julabo AWC-100 для термостата Пельтье
  • CS/LD Детектор линейного дихроизма
  • CS/ORD Вспомогательное оборудование для определения дисперсии оптического вращения
  • CS/IR Фотодетектор для ближней ИК-области спектра излучения
  • CS/LT Азотный криостат (дополнительное оборудование)
  • CS/CFR Соответствие разделу 21, части 11 Свода федеральных постановлений
  • CS/SF Модуль остановленного потока

Источник света: ксеноновая лампа мощностью 150W, воздушное охлаждение

Монохроматор: F/7 поляризующая Призма Волластона; диполяризующая, бидисперсионная оптика;

Рабочий диапазон длин волн: 160 – 1360 нм

Точность установки длины волны: ±0.2 нм (170 нм – 400 нм), ±0.5 нм (> 400 нм)

Погрешность установки длины волны: ±0.05 нм (170 нм – 400 нм), ±0.1 нм (> 400 нм)

Разрешение длин волн: 0.1 нм во всём диапазоне

Полоса пропускания:

от 0 до 2 нм @ 160 нм (при шаге 0.1 нм)
от 0 до 4 нм @ 180 нм (при шаге 0.1 нм)
от 0 до 7.5 нм @ 200 нм (при шаге 0.1 нм)
от 0 до 12нм выше 222 нм

Светорассеяние: 900 нм


Детектор

Твердотельный детектор

Практически используемый диапазон: 170нм – 1150нм

Среднеквадратичное значение шума (Все измерения на ширине полосы 1 нм; время интегрирования 2 с):

0.03 mº @ 175 нм

0.02 mº @ 180 нм

0.01 мº @ 185 нм

0.02 мº @ 200 нм

0.02 мº @ 250 нм

0.02 мº @ 500 нм

0.04 мº @ 800 нм

0.05 мº @ 1000 нм

Сканирование по длинам волн: Постоянная выборка результатов и их адаптивный отбор при пошаговом сканировании.

Кинетический режим: линейная, логарифмическая и разделённая временная развёртка

Масштаб и разрешение КД-спектра: ±1500 мº с автоматическим масштабированием; разрешающая способность > 0.025 мº при 1500 мº

Режимы детектирования

Спектроскопические исследования: одновременная регистрация спектров кругового дихроизма и поглощения, настраивается для FDCD (стандарт) и флуоресценции

Остальные исследования: одновременная регистрация температуры, высокого напряжения, заданного постоянного тока.

Параметры расхода газа-носителя (азот):
5л/мин (все длины волн)
2л/мин (выше 200 нм)

Время запуска: 15 минут

Программное обеспечение
Pro-Data control & viewer software, программное обеспечение для структурного анализа CDNN, APL data converter.ОС: Windows XP Professional

Параметры энергопотребления: 220/240, 110 В. 440 ВА

Доступные опции
Одно- или многокамерный термостат Пельтье, титратор, модуль для магнитной КД-спектроскопии, модуль флуоресцентного детектирования, монохроматор для флуоресцентного сканирования, детектор для работы в ближней ИК-области спектра, криостат, модуль остановленного потока, модуль определения дисперсии оптического вращения и линейного дихроизма, FDA: Соответствует разделу 21, части 11 CFR
  • CS Plus A study to validate DMS.pdf (Application note)
  • CS Plus DMS Formulation stability of an antibody.pdf (Application note)
  • Chirascan-plus.pdf (Technical datasheet)
  • Chirascan-Plus DMS Brochure.pdf
  • Chirascan qCD RUS.pdf (Брошюра Chirascan на русском языке)
  • Chirascan_Platform_Brochure_final_screen.pdf (Общая брошюра по семейству Chirascan на английском языке)
  • Product-Information-Sheet_Chirascan-V100.pdf (Брошюра Chirascan V100 на английском языке)