Patch clamp системы IonFlux

• Лиганд-зависимые ионные каналы:

Планшетная микрожидкостная технология, применяемая в системе IonFlux, обеспечивает добавление вещества во все лунки планшета одновременно. Такие возможности прибора существенно увеличивают пропускную способность исследования (на анализ мишеней лиганд-зависимого ионного канала в одном планшете уходит 8 минут, это время может увеличиваться за счет увеличения сроков инкубации с веществом). Длительная перфузия существенно улучшает процесс отмывки от лиганда, позволяя изучать такие интересные мишени, как NMDA-рецептор.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Длительная перфузия;
• Высокое качество отмывки (> 50x кратная смена объема на один цикл отмывки);
• Неограниченные возможности вариации протоколов (множество повторов без дополнительных задержек между добавлением вещества);
• Высокая воспроизводимость результатов за счет регистрации сигнала от группы клеток.

Наиболее частое применение:

• Поиск лигандов GABA-рецептора;
• Исследование NMDA-рецепторов;
• Изучение никотиновых рецепторов;
• Анализ фармакологических свойств P2X пуринергических рецепторов.

Рисунок 1- Кривая зависимости активности NMDA-рецептора от увеличения концентрации лиганда.

Исследования NMDA-рецептора крайне перспективны, поскольку его активация является критическим событием для жизни и функционирования клетки.
Отмывка клеток в таких экспериментах должна проводиться качественно и быстро.
Представленный график на рисунке 1 получен с помощью уникального протокола для системы  IonFlux: действие трех последовательно увеличивающихся концентраций лиганда исследовалось поочередно без потери времени и разделялось лишь отмывкой  буфером между измерениями.

Чтобы проследить изменения в ответ на действие вещества, полумаксимальная эффективная концентрация EC50 анализировалась отдельно в каждой группе регистрируемых клеток.

• Потенциал-зависимые ионные каналы:

Потенциал-зависимые ионные каналы ответственны за форму, длительность и частоту потенциалов действия в возбудимых клетках. Выполняя эту значимую физиологическую роль, они стали важным объектом исследования при разработке новых лекарственных средств. Потенциал-зависимые каналы также контролируют физиологические функции в невозбудимых клетках, например в секреторных эпителиальных клетках.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Высокоточная регистрация в зоне гигаомного контакта;
• Удобный для длительной перфузии метод фиксации концентраций;
• Высокая воспроизводимость результатов при регистрации сигнала от группы клеток;
• Исследование скорости диссоциации веществ;
• Возможность компенсации сопротивления утечки (R_leak) и последовательного сопротивления (R_series).

Наиболее частое применение:

• Скрининг эффективности веществ;
• Получение профилей исследуемых соединений (определение концентрации полумаксимального ингибирования IC₅₀);
• Скрининг мутантных клеточных линий;
• Исследование механизмов действия веществ;
• Изучение натриевых (Na_v) and калиевых (K_v) каналов.

Рисунок 2 — График сдвига концентрации полумаксимального ингибирования IC50 блокатора натриевого канала лидокаина при различных стабилизированных значениях напряжения, демонстрирующий взаимосвязь состояния канала и фармакологических свойств лидокаина.

Выраженный ответ на поэтапное увеличение потенциала от -120мВ до +20мВ  при оценке влияния величины потенциала на ионные токи потенциал-зависимого натриевого канала Nav1.8. Данный эксперимент показывает достижение пиковых  значений силы тока (выше 2нА) в 90% анализируемых групп клеток. Это хороший показатель для мишени, функция которой может нарушаться при небольшом изменении  тока.

• Скрининговый анализ фармакологической безопасности веществ, токсикологические исследования калиевых каналов сердца hERG:

В силу сложности и высокой стоимости тестов in vivo, калиевые каналы hERG (human Ether-a-go-go-Related Gene) типа продолжают служить индикатором потенциальной эффективности кардиологических средств.

Возможность проведения недорогих исследований на ранних стадиях поиска новых лекарственных веществ является чрезвычайно важной в фармацевтической индустрии.

Система IonFlux отлично подходит для профилирования веществ, влияющих на активность hERG каналов. В силу ее готовности работать со сложными для анализа веществами (плохая растворимость, высокая липофильность) и серьезные преимущества в пропускной способности, высокая воспроизводимость результатов, и стоимость, сравнимая с затратами на другие типы исследований.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Усовершенствованный способ фиксации концентраций благодаря непрерывной перфузии;
• Высокая воспроизводимость и успешность опытов благодаря возможности регистрации потенциала от группы клеток;
• Контроль температуры.

Наиболее частое применение:

• Получение профилей фармакологической безопасности веществ для калиевых каналов hERG (исследование IC₅₀);
• Скрининг веществ по их способность влиять на лабильность hERG-каналов;
• Изучение hERG-каналов при физиологических температурах.

• Температурно-зависимые эффекты:

Температура может влиять как на кинетику ионных каналов, так и на фармакологический ответ исследуемых веществ.

На базе уникальной микрожидкостной технологии возможно проведение экспериментов при физиологических температурах с высокой пропускной способностью.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Первоклассный контроль температуры, отсутствие скачков температуры во время смены растворов;
• Высокая достоверность результатов за счет поддержания постоянной температуры в ходе разных экспериментов;
• Температуру можно повышать после стадии формирования контакта, что увеличивает число успешных повторов;
• Быстрое время установления постоянной температуры (30-60 сек.).

Наиболее частое применение:

• Исследования фармакологической безопасности веществ;
• Изучение кинетики натриевых каналов (Na_v 1.1 – 1.8);
• Изучение кинетики калиевых каналов (K_v1.1 – 11.1);
• Анализ активности веществ, приводящих к порации мембраны.

• Универсальная система для Вашей лаборатории:

IonFlux представлен в трех конфигурациях, имеющих широкий диапазон практического применения:

• Первая, IonFlux Mercury 16 — обладает новой оптимизированной системой обмена жидкостями, стандартизированным температурным контролем;
• Вторая, IonFlux Mercury HT — имеет 64 независимых канала регистрации сигнала, разраб_отана для средне- и высокопроизводительного скрининга большого числа лигандов ионных каналов;
• Третья, IonFlux Classic 16 — идеально подходит для исследования работы ионных каналов в академических лабораториях.

• Высокое качество исследований и широкий диапазон применения:

Планшет IonFlux может быть использован для регистрации ионного тока и потенциала в одиночной клетке в месте гигаомного контакта.

Эта функция прибора идентична неавтоматизированному рутинному методу фиксации потенциала. Кроме того, возможен вариант единовременного исследования группы из двадцати клеток с регистрацией общего потенциала на одном усилителе. Это обеспечивает достоверность исследований и самый высокий для данного метода показатель эффективности (более 90%). Высокая результативность и универсальность системы IonFlux делают ее идеальной для использования в высокопропускном скрининге, фармакологических и токсикологических исследованиях.

В системе IonFlux используется инновационная Планшетная микрожидкостная технология (Well Plate Microfluidic). С ее помощью в микронном диапазоне заполняются струйные каналы в днище планшетов SBS-формата. Применение планшетов такого типа позволяет при необходимости использовать их в уже имеющихся лабораторных приборах, что обеспечивает высокий уровень функциональности и множество возможностей при изучении ионных каналов.

Система IonFlux – универсальный прибор, расширяющий возможности автоматизированных электрофизиологических исследований, позволяющий снизить стоимость отдельной полученной в эксперименте точки.

IonFlux поможет Вам в решении любых исследовательских задач в области изучения ионных каналов и поиска новых лекарственных средств.

• Перенос клеток и реагентов в лунки планшета:

Каждый планшет IonFlux содержит матрицу из экспериментальных паттернов. Каждый экспериментальный паттерн содержит 12 лунок: 8 — для анализируемых веществ, 2 – для иммобилизации клеток и захвата мембраны (лунки-«ловушки»), 2 — для ввода и вывода клеток. Клетки помещаются в лунку для ввода клеток, лунки для иммобилизации клеток заполняются буфером, а 8 оставшихся лунок заполняются буфером с добавлением 8 различных исследуемых веществ или с добавлением разных концентраций одного вещества для доза зависимого анализа.

Рисунок 1- 384-луночный планшет Ion Flux с экспериментальными паттернами. 

• Клетки собираются в клеточную группу или удерживаются в виде одиночных клеток:

Клетки проталкиваются через основной проточный канал действием создаваемого в системе давления. Затем клетки попадают в более мелкие каналы, похожие на пэтч-пипетки.
В одном экспериментальном паттерне возможен анализ двух групп из 20 клеток или двух одиночных клеток, при этом все клетки подвергаются действию одних и тех же компонентов 8 исследуемых лунок. Таким образом с одного паттерна пользователь получает восемь экспериментальных точек в двойном объеме, что повышает достоверность исследования.

• Исследуемый ток детектируется от группы клеток или от одиночной иммобилизированной клетки:

Электроды прибора вступают в жидкостный контакт с участками, где ведется измерение. Ток регистрируется как от группы клеток, так и от одиночной клетки с помощью отдельных усилителей. Регистрация потенциала от группы клеток дает высокий показатель эффективности, так как выдает усредненные значения сигнала от 20 клеток. Регистрация одиночных клеток дает максимально достоверные точные данные. В промежутках между исследованием действия различных веществ, клетки могут быть полностью отмыты от исследуемых растворов. Система непрерывно регистрирует сигнал, что позволяет исследовать работу быстродействующих ионных каналов.

Рисунок 2- Регистрация потенциала от группы из 20 клеток.

• Comparison of Cell Expression Formats for the Characterization of GABAA Channels Using a Microfluidic Patch. Clamp SystemChen, Q. Yim, P. Yuan, N. Johnson, J., Cook, J. Smith, S. Ionescus-Zanetti, C., Want, Z. Arnold, L. Emala, C. Assay Drug Dev Technol. 2012;
• Ion Channel Pharmacology Under Flow: Automation Via Well-Plate Microfluidics
  Spencer, C.I., Li, N. Chen, Q., Johnson, J., Nevill, T., Kammonen, J., Ionescu-Zanetti, C. Assay Drug Dev Technol. 2012.

• Листовка IonFlux Classic 16 eng;
• Брошюра IonFlux Poduct eng;
• Листовка IonFlux Mercury eng;
• Новые решения для LifeScience — полный каталог оборудования.