Patch clamp системы IonFlux

Применение при поиске и исследовании новых лекарственных средств

Лиганд-зависимые ионные каналы

Планшетная микрожидкостная технология, применяемая в системе IonFlux, обеспечивает добавление вещества во все лунки планшета одновременно. Такие возможности прибора существенно увеличивают пропускную способность исследования (на анализ мишеней лиганд-зависимого ионного канала в одном планшете уходит 8 минут, это время может увеличиваться за счет увеличения сроков инкубации с веществом). Длительная перфузия существенно улучшает процесс отмывки от лиганда, позволяя изучать такие интересные мишени, как NMDA-рецептор.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Длительная перфузия;
• Высокое качество отмывки (> 50x кратная смена объема на один цикл отмывки);
• Неограниченные возможности вариации протоколов (множество повторов без дополнительных задержек между добавлением вещества);
• Высокая воспроизводимость результатов за счет регистрации сигнала от группы клеток.

Наиболее частое применение:

• Поиск лигандов GABA-рецептора;
• Исследование NMDA-рецепторов;
• Изучение никотиновых рецепторов;
• Анализ фармакологических свойств P2X пуринергических рецепторов.

Кривая зависимости активности NMDA-рецептора от увеличения концентрации лиганда. Исследования NMDA-рецептора крайне перспективны, поскольку его активация является критическим событием для жизни и функционирования клетки.
Отмывка клеток в таких экспериментах должна проводиться качественно и быстро.
Представленный график получен с помощью уникального протокола для системы  IonFlux: действие трех последовательно увеличивающихся концентраций лиганда исследовалось поочередно без потери времени и разделялось лишь отмывкой  буфером между измерениями. Чтобы проследить изменения в ответ на действие вещества, полумаксимальная эффективная концентрация EC50 анализировалась отдельно в каждой группе регистрируемых клеток.

Потенциал-зависимые ионные каналы

Потенциал-зависимые ионные каналы ответственны за форму, длительность и частоту потенциалов действия в возбудимых клетках. Выполняя эту значимую физиологическую роль, они стали важным объектом исследования при разработке новых лекарственных средств. Потенциал-зависимые каналы также контролируют физиологические функции в невозбудимых клетках, например в секреторных эпителиальных клетках.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Высокоточная регистрация в зоне гигаомного контакта;
• Удобный для длительной перфузии метод фиксации концентраций;
• Высокая воспроизводимость результатов при регистрации сигнала от группы клеток;
• Исследование скорости диссоциации веществ;
• Возможность компенсации сопротивления утечки (R_leak) и последовательного сопротивления (R_series).

Наиболее частое применение:

• Скрининг эффективности веществ;
• Получение профилей исследуемых соединений (определение концентрации полумаксимального ингибирования IC₅₀);
• Скрининг мутантных клеточных линий;
• Исследование механизмов действия веществ;
• Изучение натриевых (Na_v) and калиевых (K_v) каналов.

Выраженный ответ на поэтапное увеличение потенциала от -120мВ до +20мВ  при оценке влияния величины потенциала на ионные токи потенциал-зависимого натриевого канала Nav1.8. Данный эксперимент показывает достижение пиковых  значений силы тока (выше 2нА) в 90% анализируемых групп клеток. Это хороший показатель для мишени, функция которой может нарушаться при небольшом изменении  тока.
Вложенный график: сдвиг концентрации полумаксимального ингибирования IC50 блокатора натриевого канала лидокаина при различных стабилизированных значениях напряжения, демонстрирующий взаимосвязь состояния канала и фармакологических свойств лидокаина.

Скрининговый анализ фармакологической безопасности веществ, токсикологические исследования калиевых каналов сердца hERG

В силу сложности и высокой стоимости тестов in vivo, калиевые каналы hERG (human Ether-a-go-go-Related Gene) типа продолжают служить индикатором потенциальной эффективности кардиологических средств.

Возможность проведения недорогих исследований на ранних стадиях поиска новых лекарственных веществ является чрезвычайно важной в фармацевтической индустрии.

Система IonFlux отлично подходит для профилирования веществ, влияющих на активность hERG каналов. В силу ее готовности работать со сложными для анализа веществами (плохая растворимость, высокая липофильность) и серьезные преимущества в пропускной способности, высокая воспроизводимость результатов, и стоимость, сравнимая с затратами на другие типы исследований.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Усовершенствованный способ фиксации концентраций благодаря непрерывной перфузии;
• Высокая воспроизводимость и успешность опытов благодаря возможности регистрации потенциала от группы клеток;
• Контроль температуры.

Наиболее частое применение:

• Получение профилей фармакологической безопасности веществ для калиевых каналов hERG (исследование IC₅₀);
• Скрининг веществ по их способность влиять на лабильность hERG-каналов;
• Изучение hERG-каналов при физиологических температурах.

Температурно-зависимые эффекты

Температура может влиять как на кинетику ионных каналов, так и на фармакологический ответ исследуемых веществ. На базе уникальной микрожидкостной технологии возможно проведение экспериментов при физиологических температурах с высокой пропускной способностью.

Основные преимущества данного класса исследований:

• Первоклассный контроль температуры, отсутствие скачков температуры во время смены растворов;
• Высокая достоверность результатов за счет поддержания постоянной температуры в ходе разных экспериментов;
• Температуру можно повышать после стадии формирования контакта, что увеличивает число успешных повторов;
• Быстрое время установления постоянной температуры (30-60 сек.).

Наиболее частое применение:

• Исследования фармакологической безопасности веществ;
• Изучение кинетики натриевых каналов (Na_v 1.1 – 1.8);
• Изучение кинетики калиевых каналов (K_v1.1 – 11.1);
• Анализ активности веществ, приводящих к порации мембраны.

Универсальная система для Вашей лаборатории

IonFlux представлен в трех конфигурациях, имеющих широкий диапазон практического применения. Первая, IonFlux Mercury 16, обладает новой оптимизированной системой обмена жидкостями, стандартизированным температурным контролем. Вторая, IonFlux Mercury HT, имеет 64 независимых канала регистрации сигнала, разраб_отана для средне- и высокопроизводительного скрининга большого числа лигандов ионных каналов. Третья, IonFlux Classic 16, идеально подходит для исследования работы ионных каналов в академических лабораториях.

Высокое качество исследований и широкий диапазон применения

Планшет IonFlux может быть использован для регистрации ионного тока и потенциала в одиночной клетке в месте гигаомного контакта. Эта функция прибора идентична неавтоматизированному рутинному методу фиксации потенциала. Кроме того, возможен вариант единовременного исследования группы из двадцати клеток с регистрацией общего потенциала на одном усилителе. Это обеспечивает достоверность исследований и самый высокий для данного метода показатель эффективности (более 90%). Высокая результативность и универсальность системы IonFlux делают ее идеальной для использования в высокопропускном скрининге, фармакологических и токсикологических исследованиях.

В системе IonFlux используется инновационная Планшетная микрожидкостная технология (Well Plate Microfluidic). С ее помощью в микронном диапазоне заполняются струйные каналы в днище планшетов SBS-формата. Применение планшетов такого типа позволяет при необходимости использовать их в уже имеющихся лабораторных приборах, что обеспечивает высокий уровень функциональности и множество возможностей при изучении ионных каналов.

Система IonFlux – универсальный прибор, расширяющий возможности автоматизированных электрофизиологических исследований, позволяющий снизить стоимость отдельной полученной в эксперименте точки. IonFlux поможет Вам в решении любых исследовательских задач в области изучения ионных каналов и поиска новых лекарственных средств.

1. Перенос клеток и реагентов в лунки планшета
   Каждый планшет IonFlux содержит матрицу из экспериментальных паттернов. Каждый экспериментальный паттерн содержит 12 лунок: 8 — для анализируемых веществ, 2 – для иммобилизации клеток и захвата мембраны (лунки-«ловушки»), 2 — для ввода и вывода клеток. Клетки помещаются в лунку для ввода клеток, лунки для иммобилизации клеток заполняются буфером, а 8 оставшихся лунок заполняются буфером с добавлением 8 различных исследуемых веществ или с добавлением разных концентраций одного вещества для доза зависимого анализа.
   
   384-луночный планшет Ion Flux с экспериментальными паттернами.
    
2. Клетки собираются в клеточную группу или удерживаются в виде одиночных клеток
   Клетки проталкиваются через основной проточный канал действием создаваемого в системе давления. Затем клетки попадают в более мелкие каналы, похожие на пэтч-пипетки.
   В одном экспериментальном паттерне возможен анализ двух групп из 20 клеток или двух одиночных клеток, при этом все клетки подвергаются действию одних и тех же компонентов 8 исследуемых лунок. Таким образом с одного паттерна пользователь получает восемь экспериментальных точек в двойном объеме, что повышает достоверность исследования.
   
    
3. Исследуемый ток детектируется от группы клеток или от одиночной иммобилизированной клетки
   Электроды прибора вступают в жидкостный контакт с участками, где ведется измерение. Ток регистрируется как от группы клеток, так и от одиночной клетки с помощью отдельных усилителей. Регистрация потенциала от группы клеток дает высокий показатель эффективности, так как выдает усредненные значения сигнала от 20 клеток. Регистрация одиночных клеток дает максимально достоверные точные данные. В промежутках между исследованием действия различных веществ, клетки могут быть полностью отмыты от исследуемых растворов. Система непрерывно регистрирует сигнал, что позволяет исследовать работу быстродействующих ионных каналов.
   
   Регистрация потенциала от группы из 20 клеток.

Ligand-gated Ion Channels:

• Recording of GABAA Receptor-mediated Cl- Currents Using the IonFlux Platform;
• Recording of Endogenous GABAA Channel in Human Airway Smooth Muscle Cells Using the IonFlux System;
• Recording of Nicotinic Acetylcholine Receptors (nAChR α1) Receptor Currents Using the IonFlux system;
• Transiently Transfected Cell Lines for GABA Receptor Screening Using the IonFlux System.

Voltage-gated Ion Channels:

• hERG K+ Channel Currents and Pharmacology Using the IonFlux System;
• Temperature Dependent hERG Channel Pharmacology and Kinetics on the IonFlux System;
• Nav 1.7 and 1.8 Recordings on the IonFlux System

Related Publications:

• Comparison of Cell Expression Formats for the Characterization of GABAA Channels Using a Microfluidic Patch
  Clamp SystemChen, Q. Yim, P. Yuan, N. Johnson, J., Cook, J. Smith, S. Ionescus-Zanetti, C., Want, Z. Arnold, L. Emala, C. Assay Drug Dev Technol. 2012;
• Ion Channel Pharmacology Under Flow: Automation Via Well-Plate Microfluidics
  Spencer, C.I., Li, N. Chen, Q., Johnson, J., Nevill, T., Kammonen, J., Ionescu-Zanetti, C. Assay Drug Dev Technol. 2012.

• IonFlux Classic Data Sheet;
• IonFlux Poduct Brochure;
• IonFlux Mercury Data Sheet