Система NanoTemper Prometheus NT.Plex

Nanotemper — системы для анализа структуры и взаимодействий биомолекул, купить оборудование Nanotemper в Техноинфо Nano temper PrometheusNT.Plex купить в Техноинфо

Система изучения конформационной и термической стабильности белков, анализа химической денатурации и агрегации на основе технологии nanoDSF.



Система Prometheus NT.48 точно характеризуют термическую и химическую денатурацию, агрегацию. В своих исследованиям Вы сможете получить точные температуры денатурации (Tm и Tonset), критические денатурирующие концентрации (Cm), энергии свободного сворачивания (ΔG и ΔΔG) и результаты агрегации (Tagg).

Система Prometheus NT.48 на основе nanoDSF идеально подходит для:

  • Скрининга буферов, рецептурных и буферных добавок, детергентов
  • Анализа термической и химической денатурации белка
  • Долгосрочная оптимизации хранения белков и антител
  • Тестов на устойчивость к принудительному разложению
  • Сравнения биоподобных белков и антител по стабильности и агрегации
  • Сплошного анализа партии
  • Анализа большого количества параметров (влияние мутаций, модификаций, конъюгаций на стабильность и агрегацию белка)

Количество образцов за цикл: до 24 (вручную)

Требуемый объем образца: 10 мкл

Диапазон обнаруживаемых концентраций молекул: 0,005 – 250 мг/мл (стандартный IgG)

Время проведения эксперимента — термическая денатурация (от 1 °C/мин до 7 °C/мин): 18 – 75 минут

Время проведения эксперимента — химическое развертывание: 1 минута

Точность теплового перехода 1 °С/мин: ± 0,2 °С

Термоконтроль:

  • Варианты выбора: от 0,1 °С/мин до 7 °С/мин
  • Диапазон температур: 15 – 95 °С (при температуре окружающей среды 25 °С)

Регистрация флуоресценции: 330 нм и 350 нм

Размеры: 35 см Ш x 51 см Ш x 52 см Д

Вес: 30 кг

Дополнительные возможности:

  • Оптика для обнаружения агрегации
  • Повышение температуры до 15 – 110 °C (при температуре окружающей среды 25 °C)

Метод nanoDSF предлагает множество преимуществ по сравнению с традиционными методами флуориметрии. В отличие от стандартной дифференциальной сканирующей флуориметрии, nanoDSF не требует использования флуоресцентных красителей, таких как Sypro Orange.

  • Низкое потребление образца → требуется всего 10 мкл образца
  • Свободный выбор буферов для анализа → возможны также биологические жидкости, такие как сывороточный или клеточный лизат и другие добавки/детергенты
  • Очень короткое время анализа → обеспечивает высокую пропускную способность
  • Оптимальное качество данных и разрешение → двойное УФ-обнаружение на длинах волн 350/330 нм
  • Широкий диапазон температур → возможен анализ от 15 °C до 95 °C
  • Не требуется маркировка → возможен непосредственный анализ
  • Широкий диапазон концентраций от 5 мкг/мл до 200 мг/мл
  • Широкий диапазон размеров молекул → от 1 кДа до 1 МДа

NanoDSF — метод нано-дифференциальной сканирующей флуориметрии, способен анализировать конформационную и коллоидную стабильность (поведение при агрегации) белков в различных термических и химических условиях. Конформационная стабильность белка описывается его средней температурой денатурации T(°C), которая является точкой, где разворачивается половина белка. Техника nanoDSF детектирует внутреннюю флуоресценцию триптофана белков, которая очень чувствительна и изменяется при термическом разворачивании.

До 24 капиллярных чипов заполняются 10 мкл образца и одновременно сканируются на длинах волн 330/350 нм. Температуры плавления регистрируются путем мониторинга изменений собственной флуоресценции триптофана, а температуры начала агрегации регистрируются с помощью рассеяния света с обратным отражением. Образцы могут быть нагреты до любой температуры в диапазоне от 25 °С до 95 °С. Важно отметить, что образцы могут быть изучены без использования красителя и со свободным выбором буфера. Температуры плавления белков с концентрацией от 5 мкг/мл до 250 мг/мл могут быть проанализированы. Для получения высоких температур начала агрегации требуются белковые растворы с концентрациями выше 1 мг/мл.

NanoDSF (нано-дифференциальная сканирующая флуориметрия) — это быстрый, надежный, высококачественный метод, не требующий флуоресцентных меток и растворов для анализа стабильности белка, термической денатурации белка и анализа температуры плавления на основе собственной флуоресценции триптофана. NanoDSF является отличным инструментом для скрининга буферов и детергентов, а также позволяет анализировать коллоидную стабильность растворов белков (агрегацию).

В целом, собственная флуоресценция триптофана белков сильно зависит от их 3D-структуры и, следовательно, от локального окружения остатков триптофана. При использовании химических денатуратов или термического градиента белки могут быть развернуты, что приводит к изменениям собственной флуоресценции триптофана. Это приводит к сдвигу пиков флуоресцентного излучения и изменениям интенсивности. NanoDSF отслеживает эти флуоресцентные изменения с высоким временным разрешением и может выявить даже несколько разворачивающихся переходов. Поэтому NanoDSF весьма успешен в разработке антител, характеристике мембранных белков, контроле качества белка, скрининге буфера, анализе разворачивания белка и скрининге связывания низкомолекулярных соединений.

nanoDSF, Stability, Unfolding, Screening, Buffer

Рисунок 1. Принцип, лежащий в основе термической денатурации белка: повышение температуры вызывает денатурацию третичной структуры белка и, таким образом, остатки триптофана, подвергаются воздействию растворителя. NanoDSF отслеживает параллельные изменения флуоресценции триптофана на длинах волн 330 и 350 нм.

 

Для обнаружения агрегации белка система Prometheus NT.Plex имеет оптику с обратным отражением. Обычно видимый свет проходит через капилляры, содержащие образец интересующего белка, без каких-либо помех, отражается зеркалом на капиллярном поддоне и, наконец, количественно определяется детектором. Если образец белка содержит агрегированные частицы, падающий свет рассеивается этими частицами. Потеря интенсивности отражения является точным показателем агрегации белка.

Structural basis of α-scorpion toxin action on Nav channels

Thomas Clairfeuille, Alexander Cloake, Daniel T. Infield, José P. Llongueras, Christopher P. Arthur, Zhong Rong Li, Yuwen Jian, Marie-France Martin-Eauclaire, Pierre E. Bougis, Claudio Ciferri, Christopher A. Ahern, Frank Bosmans, David H. Hackos, Alexis Rohou, Jian Payandeh. Science, vol.363, 6433 (2019)

Towards high throughput GPCR crystallography: in meso soaking of adenosine a2a receptor crystals

Prakash Rucktooa, Robert K. Y. Cheng, Elena Segala, Tian Geng, James C. Errey, Giles A. Brown, Robert M. Cooke, Fiona H. Marshall & Andrew S. Doré. Scientific Reports, vol.8, 41 (2018)

High-throughput feasible screening tool for determining enzyme stabilities against organic solvents directly from crude extracts

Severin Wedde, Dr. Christian Kleusch, Dr. Daniel Bakonyi & Prof. Dr. Harald Gröger. ChemBioChem, vol.18(24), p.2399–2403 (2018)

Zinc binding to RNA recognition motif of TDP-43 induces the formation of amyloid-like aggregates

Cyrille Garnier, François Devred, Deborah Byrne, Rémy Puppo, Andrei Yu. Roman, Soazig Malesinski, Andrey V. Golovin, Régine Lebrun, Natalia N. Ninkina & Philipp O. Tsvetkov. Scientific Reports, vol.7, 6812 (2017)

Mutagenesis-independent, stabilization of class B flavin monooxygenases in operation

Goncalves L, Kracher D, Milker S, Rudroff F, Fink M, Ludwig R, Bommarius A, Mihovilovic M. Advanced Synthesis & Catalysis, 359, p.2121–2131 (2017)

Conformational and functional transitions and in silico analysis of a serine protease from conidiobolus brefeldianus (MTCC 5185)

Shukla E, Agrawal S, Gaikwad S. International Journal of Biological Macromolecules, vol.98, (Mtcc 5185) p.387-397 (2017)

Understanding the process-induced formation of minor conformational variants of erwinia chrysanthemi  l-asparaginase

David Gervais, Justin Hayzen, Charlotte Orphanou, Alexandra McEntee, Christine Hallam & Rossalyn Brehm. Enzyme and Microbial Technology, vol.98, p.26-33 (2017)

Creating an efficient methanol-stable biocatalyst by protein & immobilization engineering steps towards efficient biosynthesis of biodiesel

 Shalev Gihaz, Diána Weiser, Adi Dror, Péter Sátorhelyi, Moran Jerabek-Willemsen, Dr. László Poppe, Dr. Ayelet Fishman. ChemSusChem, vol.9, p.3161–3170 (2017)

The deubiquitinase OTULIN is an essential negative regulator of inflammation and autoimmunity

Rune Busk Damgaard, Jennifer A. Walker, Paola Marco-Casanova, Neil V. Morgan, Hannah L. Titheradge, Paul R. Elliott, Duncan McHale, Eamonn R. Maher, Andrew N.J. McKenzie & David Komander. Cell, vol.166, p.1215-1230 (2016)

Structural and functional basis for lipid synergy on the activity of the antibacterial peptide ABC transporter McjD

Mehmood S, Corradi V, Choudhury H, Hussain R, Becker P, Axford D, Zirah S, Rebuffat S, Tieleman D, Robinson C, Beis K. Journal of Biological Chemistry, vol.291 (41), p.21656-21668 (2016)