Система NanoTemper Monolith NT.LabelFree

Nanotemper — системы для анализа структуры и взаимодействий биомолекул, купить оборудование Nanotemper в Техноинфо Система NanoTemper Monolith NT.LabelFree купить в Техноинфо

Система анализа аффинностей межмолекулярных взаимодействий без использования флуоресцентных меток на основе метода микроскопического термофореза.



Микроскопический термофорез (МСТ) основан на измерении подвижности молекул в температурном градиенте. Образование комплекса молекулы с лигандом приводит к изменению свойств молекулы: заряда, размера, гидратной оболочки и т.д. Это влияет на термофоретическую подвижность. Сопоставляя термофоретические кривые для молекул при разной концентрации лиганда, программное обеспечение вычисляет константу диссоциации, характеризующую силу взаимодействия молекулы с лигандом (аффинность).

Метод МСТ позволяет делать точные количественные оценки самых разных бимолекулярных взаимодействий (например, белок–лиганд, белок–белок, белок–нуклеиновая кислота и т.д.). Измерения можно проводить непосредственно в биологических жидкостях, что приближает условия к естественным, исключает необходимость иммобилизации молекул и просто экономит время. Всё это делает микроскопический термофорез привлекательным методом как для фундаментальных исследований, так и для биомедицинских приложений.

Схема эксперимента

А — Раствор с исследуемыми флуоресцирующими молекулами помещают в капилляры по 4 мкл. В каждый капилляр добавляют молекулу-партнёр (нефлуоресцирующую) в разных концентрациях. Регистрируют начальную флуоресценцию, чтобы определить точные координаты капилляров.

Б — Регистрируют термофоретическую кривую (показана кривая для 1 капилляра). Для этого капилляр освещают ИК-лазером (включение и выключение ИК-лазера обозначено красной стрелкой вверх и вниз соответственно). Наблюдается температурный скачок (Т-скачок) в течение 1 с. После этого начинается термофорез, и в течение 25-30 с система приходит в стационарное состояние. После выключения лазера наблюдается обратная диффузия. Наверху показана схема движения молекул (белые кружки) во время разных фаз термофореза. Красным цветом выделена область освещения ИК-лазером. Кривая представляет собой зависимость нормированной флуоресценции (Fnorm, ‰) от времени.

В — Аналогичную операцию проводят с остальными капиллярами. Черным цветом показана кривая, характерная для капилляра с нулевой концентрацией молекулы-партнёра. Темно-серым — для капилляра, в котором концентрация молекулы-партнёра была недостаточна для связывания со всеми молекулами. Серым — для капилляра с полностью связанными молекулами. Справа изображена схема движения молекул: черные кружки обозначают несвязанные молекулы, которые быстро «разбегаются» при нагревании, серые кружки — комплексы (обладают большей массой или зарядом и потому медленнее покидают область нагрева).

Г — После измерения обрабатывают результаты. Значения Fnorm пересчитывают в количество связанных молекул, или комплексов (%), и на графике откладывают относительно концентрации молекулы-партнёра.

Фаза Что влияет на фазу? Что можно определить по фазе?
Т-скачок Изменение собственной флуоресценции метки в результате изменения микроокружения при образовании комплекса Число комплексов, «жесткость» структуры
Термофорез Всё, что изменяет коэффициент диффузии и термофоретическую подвижность молекул: размер, заряд, изменения в гидратной оболочке и др. Число комплексов
Обратная диффузия Гидродинамический радиус Размер молекул
Конвекция Масса молекул Агрегация

Время эксперимента: не более 15 минут

Динамический диапазон: от 10 нM до мM

Диапазон молекул:

  • Молекулярный вес : 101–107 Да
  • Размер: 0.1 нм –1 мкм

Максимальное количество образцов за эксперимент: 16 вручную

Минимальный измеренный объем образца: 4 мкл

Термоконтроль: от 22 до 45 ᵒC (± 0.3 ᵒC) 

Каналы флуоресценции: 1 (UV)

Размеры: 33 см Ш x 45 см В x 51 см Г

Вес: 24 кг

Monolith NT.LabelFree на основе МСТ обладает рядом преимуществ перед другими методами определения аффинности:

  1. Можно исследовать образцы с низкой концентрацией без использования флуоресцентных меток;
  2. Можно исследовать взаимодействие молекул в условиях, близких к естественным: клеточном лизате и сыворотке крови;
  3. Можно исследовать взаимодействие практически любых молекул: от ионов до белковых агрегатов, взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами, фосфолипидами, ионами;
  4. Быстро, просто; константа диссоциации рассчитывается автоматически.

Метод микроскопического термофореза (МСТ, англ. microscale thermophoresis, MST) основан на движении молекул в градиенте температур (греч. Θερμη — тепло, φορεω — переношу). Температурный градиент достигается освещением капилляра с исследуемыми молекулами инфракрасным лазером. В зоне нагрева частицы движутся быстрее и «расталкивают» друг друга. Поэтому поток частиц устремляется в более холодные области капилляра (рис. 1), и их концентрация в зоне нагрева снижается (рис. 2). Изменение концентрации регистрируют по снижению флуоресценции в зоне нагрева. По сути, с помощью МСТ измеряют динамику изменения концентрации молекул в зоне нагрева. 
Метод позволяет определять наличие комплексов и силу взаимодействия молекул, потому что связывание молекул друг с другом приводит к изменению их подвижности в температурном градиенте.Термофоретический дрейф молекул

Рисунок 1. Схематичное представление термофоретического дрейфа молекул. Молекулы показаны белыми кружками. Температурный градиент представлен в псевдоцветах: красным показана холодная область, желтым — горячая.

Изменение концентрации молекул при нагреве

Рисунок 2. Изменение концентрации молекул в различных зонах капилляра при нагреве. На верхней панели — гомогенное распределение молекул в капилляре до включения ИК-лазера. После включения лазера происходит локальный нагрев содержимого капилляра, и молекулы «разбегаются» в стороны, в более холодные участки капилляра (средняя панель). Через 30-60 с система приходит в равновесие (нижняя панель). Шкала отражает относительное количество молекул в исследуемом объеме. Синий цвет — 100%, желтый — 98%, красный — 96%.

Near-native, site-specific and purification-free protein labeling for quantitative protein interaction analysis by MicroScale Thermophoresis

Tanja Bartoschik, Stefanie Galinec, Christian Kleusch, Katarzyna Walkiewicz, Dennis Breitsprecher, Sebastian Weigert, Yves A. Muller, Changjiang You, Jacob Piehler, Thomas Vercruysse, Dirk Daelemans & Nuska Tschammer. Scientific Reports, Vol.8, 4977 (2018)

Substrate-bound outward-open structure of a Na+-coupled sialic acid symporter reveals a new Na+ site

Weixiao Y. Wahlgren, Elin Dunevall, Rachel A. North, Aviv Paz, Mariafrancesca Scalise, Paola Bisignano, Johan Bengtsson-Palme, Parveen Goyal, Elin Claesson, Rhawnie Caing-Carlsson, Rebecka Andersson, Konstantinos Beis, Ulf J. Nilsson, Anne Farewell, Lorena Pochini, Cesare Indiveri, Michael Grabe, Renwick C. J. Dobson, Jeff Abramson, S. Ramaswamy & Rosmarie Friemann. Nature Communications, vol.9, 1753 (2018)

Stereotyped antibody responses target posttranslationally modified gluten in celiac disease

Omri Snir, Xi Chen, Moriah Gidoni, M. Fleur du Pré, Yuguang Zhao, Øyvind Steinsbø, Knut E.A. Lundin, Gur Yaari & Ludvig M. Sollid. JCI Insight, vol.2, e93961 (2017)

Fragment-based approach to identify IDO1 inhibitor building blocks

Alice Coletti, Francesca Camponeschi, Elisa Albini, Francesco Antonio Greco, Vincenzo Maione, Chiara Custodi, Federica Iannia, Ursula Grohmann, Ciriana Orabona, Francesca Cantini, Antonio Macchiarulo. European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 141, p.169-177 (2017)

An evaluation assay for thymine–mercuric–thymine coordination in the molecular beacon-binding system based on microscale thermophoresis

Jia Ma, Nan Liu, Li Li, Xinhua Ma, Xiaoli Li, Yanan Liu, Ya Li, Zhijiang Zhou & Zhixian Gao. Sensors and Actuators B: Chemical, vol. 252, p.680-688 (2017)

The molecular basis of phosphite and hypophosphite recognition by ABC-transporters

Claudine Bisson, Nathan B. P. Adams, Ben Stevenson, Amanda A. Brindley, Despo Polyviou, Thomas S. Bibby, Patrick J. Baker, C. Neil Hunter & Andrew Hitchcock. Nature Communications, vol. 8, 1746 (2017)

The molecular basis of phosphite and hypophosphite recognition by ABC-transporters

Claudine Bisson, Nathan B. P. Adams, Ben Stevenson, Amanda A. Brindley, Despo Polyviou, Thomas S. Bibby, Patrick J. Baker, C. Neil Hunter & Andrew Hitchcock. Nature Communications, vol.8, 1746 (2017)

Structural basis of arrestin-3 activation and signaling

Qiuyan Chen, Nicole A. Perry, Sergey A. Vishnivetskiy, Sandra Berndt, Nathaniel C. Gilbert, Ya Zhuo, Prashant K. Singh, Jonas Tholen, Melanie D. Ohi, Eugenia V. Gurevich, Chad A. Brautigam, Candice S. Klug, Vsevolod V. Gurevich & T. M. Iverson. Nature Communications, vol.8, 1427 (2017)

Ubiquitin linkage-specific affimers reveal Insights into K6-linked ubiquitin signaling

Martin A. Michel, Kirby N. Swatek, Manuela K. Hospenthal, and David Komander. Molecular Cell, vol. 68, p.233-246 (2017)

Structural determinants of 5′,6′-epoxyeicosatrienoic acid binding to and activation of TRPV4 channel

Alejandro Berna-Erro, Mercè Izquierdo-Serra, Romina V. Sepúlveda, Fanny Rubio-Moscardo, Pau Doñate-Macián, Selma A. Serra, Julia Carrillo-Garcia, Alex Perálvarez-Marín, Fernando González-Nilo, José M. Fernández-Fernández & Miguel A. Valverde. Scientific Reports, vol.7, 10522 (2017)

The monoclonal S9.6 antibody exhibits highly variable binding affinities towards different R-loop sequences

Fabian König, Thomas Schubert, and Gernot Längst. PloS ONE, vol.12, p.e0178875 (2017)

Brochure_Monolith

Термофорез: [biomolecula.ru] (дата обращения: 11.07.2019)