Флуоресцентная спектроскопия – один из базовых методов оптической молекулярной спектроскопии, который включает в себя огромное количество техник от простой съемки спектров эмиссии до времяразрешенной анизотропии и измерения абсолютных квантовых выходов.

Флуоресцентный спектрометр — это модульная система, которая открывает широкие возможности для творчества при составлении комплектации.

В зависимости от задач можно собрать как простой спектрофлуориметр с Xe лампой, который будет измерять только спектры эмиссии в видимом диапазоне, так и монстра с тремя детекторами и фемтосекундным лазером для детекции фотолюминесценции вплоть до 5,5 мкм.

Этой статьей мы открываем серию публикаций, посвященных особенностям разных компонентов флуоресцентного спектрометра. Начнем с возбуждения.

На модульный прибор можно поставить огромное количество источников возбуждения, и ни один из них не будет идеальным, поэтому важно понимать преимущества и недостатки каждого из них. Пойдем от простого к сложному:

  1. Непрерывная ксеноновая лампа. Часто рассматривается как источник по умолчанию, и это действительно универсальная вещь. Она имеет достаточно равномерный спектр по всему UV-VIS-NIR диапазону. Но обладает одним недостатком – невысокая интенсивность по сравнению с лазером или светодиодом. Даже если ваши задачи не предусматривают измерение времен жизни, можно столкнуться с ситуацией, когда даже для съемки спектра интенсивности лампы будет недостаточно, и необходимо добавлять в конфигурацию лазер или светодиод. Впрочем, разные производители используют лампы разной номинальной мощности. Однако это не значит, что лампа 150 Вт будет давать в 2 раза больше света, поскольку далеко не 100% света попадает на входную щель монохроматора, и чем выше мощность, тем эти потери больше. Обычно для фокусировки используется параболическое зеркало. Если задачи предполагают исключительно измерение времен жизни, то на лампе можно сэкономить (а вместе с ней и на возбуждающем монохроматоре). Это в большинстве приборов не является обязательным модулем.
  2. Импульсная ксеноновая лампа. Она так же, как и непрерывная дает гибкость в выборе длины волны возбуждения, и точно так же обладает невысокой мощностью по сравнению с дискретными источниками. Важно понимать, что измерять с таким источником можно будет времена жизни только фосфоресценции, то есть длительностью не короче нескольких мкс. Кроме того, потребуется дополнительная электроника для получения кинетических данных в режиме многоканального масштабирования (multichannel scaling, MCS).
  3. Наносекундная импульсная лампа. Это лампа с быстродействующим переключающим тиратроном, искровым промежутком и зарядным резистором. Принцип действия наносекундной лампы-вспышки основан на разряде, который возникает из-за электрического пробоя между двумя электродами под действием очень сильного электрического поля. Время разряда задаётся тиратроном. Такая лампа может генерировать наносекундные и субнаносекундные импульсы с частотой повторения до 50 кГц. Это не так быстро как на пикосекундном лазере (там до 20-80 МГц), но тем не менее уже можно работать в режиме TCSPC (time correlated single photon counting). Недостатком такой лампы является необходимость подключения баллонов с газом и насоса и сложность работы в целом.
  4. Импульсный лазер. Выбор импульсных твердотельных лазеров сейчас даже несмотря на санкции весьма широк. На что обратить внимание в нашем случае:

    a) Временная неопределенность. Поскольку в большинстве случаев лазер приобретается под измерения времени жизни, желательно, чтобы его временная неопределенность была меньше, чем времена жизни ваших объектов. Как правило, выделяют пс и нс лазеры. Очевидно, первые быстрее, вторые медленнее. По остальным характеристикам они как правило сопоставимы, просто нс лазеры доступнее.

    b) Частота повторения. Некоторые, например, волоконные, лазеры имеют фиксированную частоту повторения, что существенно ограничивает возможности исследования. Если частота слишком малая (то есть каждый новый импульс приходится ждать дольше), то с короткими временами жизни придется потратить существенно больше времени на измерение, зато меньше ограничений по самому длинному времени жизни, которое удастся измерить без артефактов. Обратная ситуация с высокой частотой: статистика будет набираться быстрее, но длинные времена жизни измерить будет невозможно. Пример: частота повторения 20 МГц, это значит 1 импульс в 50 нс, выходит, самое длинное время жизни, которое можно измерить будет в районе 5-15 нс, если длиннее, то хвост кинетической кривой постоянно будет обрубать следующий импульс лазера.

    c) Мощность. По умолчанию чем мощнее, тем лучше. Обычно диодный лазер дает мощность порядка 1-50 мВт. Однако высокая мощность может приводить к быстрому выгоранию образца, и здесь нужно либо предусмотреть серию фильтров нейтральной плотности на входе лазера, либо лазер сам может иметь гибкие настройки мощности.

    d) Монохроматичность. Как правило, этот фактор не играет существенной роли. Но важно понимать, что большинство дискретных лазеров, применяемых в люминесцентной спектроскопии, имеют FWHM (полная ширина на полувысоте) порядка 4-10 нм.

    e) Доступные длины волн. Условно доступные диодные лазеры имеют самую короткую длину волны 375 нм. Если нужно короче, то это либо волоконный (дорого и фиксированная частота повторения), либо светодиод (слабее по всем характеристикам кроме стоимости). 

  5. Импульсный светодиод. Выбор импульсных LED как это ни странно сейчас на рынке существенно ниже, чем лазеров. Их временная неопределенность как правило на порядок ниже, чем у лазеров, как правило это нс (хотя у некоторых производителей встречаются и пс LED). Мощность примерно на 3 порядка ниже (единицы мкВт против единиц мВт у лазеров). Монохроматичность тоже хуже (FWHM порядка 10-20 нс), а у некоторых моделей еще встречаются паразитные пики, которые нужно убирать bandpass фильтром. Тем не менее это отличный источник для, например, биологических применений, где красители достаточно медленные (органика с нс временами жизни) и достаточно чувствительные с точки зрения фотодеградации (и тогда невысокая мощность будет плюсом).
  6. Суперконтинуумный лазер. Пожалуй, самый универсальный и комфортный для работы источник. Как правило такие лазеры имеют диапазон от 420 до 2400 нм, гибкую регулировку монохроматичности, мощности и частоты повторения, то есть подходят под практически любые задачи, при этом не нужно постоянно менять головки, как в случае с дискретными источниками. Недостатка два, но они существенные: нет УФ и очень дорого.
  7. Двухфотонный лазер. Как правило это Ti:Sa фемтосекундный лазер с фиксированной частотой повторения 80 МГц. Некоторые лазеры являются перестраиваемыми, у некоторых длина волны фиксированная. Используются для ограниченного круга задач, как правило это биомедицинские приложения.

Таким образом, в настоящее время существует масса вариантов накачки вашего образца быстро, интенсивно и на любой длине волны. На модульный люминесцентный спектрометр класса SilverskAI можно установить несколько источников одновременно, например, две лампы (импульсная и непрерывная) в одном блоке, импульсный, двухфотонный или суперконтинуумный лазер (некоторые системы позволяют устанавливать сразу два лазера). Если у вас возникли вопросы, будем рады подобрать подходящий источник под ваши задачи.

В следующей статье мы поговорим о детекторах